论文导读：：接种番木瓜环斑病毒。研究CP基因发夹RNA的沉默效果。使之表达可诱发RNAi的双链RNA。短片断的核酸序列也能够起到高效抗病性。

　　论文关键词：番木瓜环斑病毒，CP基因，RNAi，抗病性，渗透法

　　番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是影响番木瓜产业的最重要的一种病毒，由它导致的番木瓜环斑病毒病（Papaya ringspot disease，PRSD）是一种分布最广、危害最严重的番木瓜病害，现已成为制约番木瓜生产的一种世界性的严重病害。传统的一些抗病毒的策略往往收效甚微。随着植物基因工程的发展，以外壳蛋白基因介导的抗病性研究为防治植物病毒病带来了新的途径（郭兴启等，2004，Tougou et al. 2006）。随着科学技术的发展和对PRSV的深入研究生物论文，以基因工程为主要研究手段的番木瓜抗病毒研究显示出巨大的潜力。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是多种生物体内由双链RNA介导的同源mRNA降解现象。植物体天然的RNAi系统并不能起到完全或较高水平地抵御某种病毒侵染的作用。如果人为地将某种病毒的某一序列设计成双链结构，导入植物体，使之表达可诱发RNAi的双链RNA，通过诱导的RNAi，强化植物体内天然的RNAi抗病毒机制，就有可能获得较高抗性的转基因植物。dsRNA介导的抗病性是近来发现并得到广泛应用的一种有效策略。由于dsRNA介导的抗病性具有一些无可比拟的优点（如单拷贝也能产生高抗的转基因植株；短片断的核酸序列也能够起到高效抗病性；入侵的病毒，其RNA会迅速被降解，不需要转入的病毒基因表达产生蛋白质产物等），使得这种抗病毒的策略具有广阔的应用价值（Voinnet，2001）。（此段是根据编辑修改意见而补充的内容）

　　Eamens et al.（2008）利用大豆矮化病毒（Soybean dwarf virus SDV）CP[微软用户1]基因构建的hpRNA转化大豆胚状体，转基因T2代植物仍保持病毒抗性论文参考文献格式。竺晓平等，（2006）利用马铃薯 Y 病毒脉坏死株系外壳蛋白（CP）基因的hpRNA表达载体转化烟草，正向重复转基因植株不表现抗病，而反向重复（IR）结构的转基因植株表现高度抗性。因此，研究CP基因发夹RNA的沉默效果，对于番木瓜的抗病毒研究有着重要的意义。

　　众多研究表明：转CP基因植物的抗病性一般可以得到稳定遗传生物论文，而且具有较小的潜在危险性，被认为是最有应用潜力的途径之一。主要原因如下：第一，外壳蛋白基因在转基因植物中可以得到稳定遗传；第二，对具有特异性抵抗病毒的能力，对亲缘关系较远的病毒不具有抗性；第三，抗病能力与转基因植物体内的蛋白产物的表达量成正比。

　　虽然CP基因介导的抗病性已经获得了很大的成功，但是仍存在一些问题：一是CP基因介导的抗病性主要表现在病毒侵染的早期，表现在只是延迟发病，当存在高接种量或重复接种时则会破坏其抗性；二是利用CP基因介导的抗病性具有潜在的危险性，因为外壳蛋白对其它病毒的包壳作用可能会导致非蚜传病毒变为蚜传病毒（Hammond et al，1980）。因此，研究人员担心导入的基因可能与植物基因重组导致产生新的病毒。

　　（此段是根据编辑修改意见而补充的内容）

　　目前，已成功应用的病毒来源的基因介导的抗性主要包括外壳蛋白基因（Zrachya et al. 2007）、复制酶基因（Sanford et al，1985；Palukaitiset al，1984）、移动蛋白基因和病毒核酸等（庞俊兰，2002）。同时由于在植物中诱发RNAi沉默过程能有效抵御病毒的入侵，因此构建病毒基因的反向重复结构并将其导入到受体材料中生物论文，能够获得高抗该病毒的植株（Waterhouse et al，2002）。

　　本研究将实验室已经构建好的含有CP基因的反向重复表达载体进行了模式植物烟草和拟南芥的遗传转化，并利用渗透法建立了番木瓜的农杆菌瞬时表达体系。同时对转化植株进行攻毒实验，监测转基因植物的抗病性以及抗病机制。比较PRSV病毒在其寄主植物和非寄主植物上RNAi效应的差异。通过强化植物体的RNAi抗病效应，为培育抗PRSV的番木瓜品种提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料和试剂

　　拟南芥（Arabidopsis thaliana）：哥伦比亚0号由华中农业大学胡春根教授提供；烟草（Nicotiana tabacum）：k236由华中农业大学陈守文教授提供；番木瓜‘夏威夷’（CaricapapayaL.）：；大肠杆菌（Escherichia coli）菌株：DH5α；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株：GV3101；质粒：pHellsgate12-CPIR（简称pHG12-CPIR） （结构如图1）均由国家果树脱毒种质资源室内保存中心脱毒研究室提供。转化pHG12-CPIR的烟草植株由本研究室硕士生王莉转化，作者进一步通过组织培养继代培养而成（此句补充后，更准确地解释材料的来源）。感染番木瓜环斑病毒的番木瓜病叶样品由广东省农业科学院果树研究所提供。

　　'夷cifulltobacoo and PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，植物RNA提取TrizolReagent购自Invitrogn公司，RT-PCR试剂盒购自北京Bio Dev生物技术有限公司，其他常用试剂为国产分析纯。番木番CP基因P5、P4和T2引物序列根据文献（姜玲等，2008）中测定的序列合成。NPTⅡ基因的引物根据pBI121载体序列合成。ACTIN Nt、ACTINPa和ACTINAt基因的引物根据文献（代晓燕等，2008）合成（表1）。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成论文参考文献格式。

　　番木瓜环斑病毒番木瓜环斑病毒

　　图1.pHellsgate12-CPIR干涉表达载体示意图

　　Fig.1.Sketch map of pHellsgate12-CPIRinterference expression vector

　　表1 应用在本项研究中的PCR引物及序列

　　Table 1 PCR primers and their sequences usedin this study

　　基因Gene

　　引物代号

　　Primer code

　　序列 Sequence

　　（5′to 3′）

　　CP

　　P5（+）

　　atgtccaagaatgaagct

　　P4（-）

　　ttagttgcgcatacccaggag

　　T2（+）

　　ctcgctagatatgctttcgatttc

　　NPTⅡ

　　nptⅡ（+）

　　ctctgatgccgccgtgttcc

　　nptⅡ（-）

　　gcccaatagcagccagtccc

　　ACTINNt

　　actinNt（+）

　　ggtagctccacctgagaggaagt

　　actinNt（-）

　　gcctttgcaatccacatctgt

　　ACTIN Pa

　　actinPa（+）

　　ttgattttgagcaggagcttga

　　actinPa（-）

　　tgagtgatggctggaagagaac

　　ACTINAt

　　actinAt（+）

　　atcgctgaccgtatgag

　　actinAt（-）

　　tgagggaagcaagaatg

　　1.2 方法

　　1.2.1 植物总 RNA 的提取 总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行，RNA于-70℃保存。操作在超净工作台上进行，试剂用 DEPC 水配制。

　　1.2.2 植株接种番木瓜环斑病毒 根据文献（魏军亚，2006，Valentineetal., 2005）并做适当改进：取含有番木瓜环斑病毒的番木瓜叶样适量，按照1：10（w/v）的比例加入PBS磷酸缓冲液生物论文，充分研磨。将匀浆液加入到1.5 mL离心管中，6000 rpm，4℃冷冻离心10 min。冰上放置，取上清液作为病毒接种液。选取4～6叶期的健康植株，在叶正面撒上少量石英砂，由叶脉向叶尖顺势轻轻摩擦整个叶片表面。而后滴加接种液并将接种液在叶片表面涂抹均匀。接种液固定为10 μL，接种结束后立即用蒸馏水冲洗接种叶表面。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理。将接种后的植株移入温室中培养，适当时间后观察表型变化并做分析。

　　1.2.3 RT-PCR RT反应采用Bio Dev通用RT-PCR试剂盒（M-MLV）说明书进行。将配制的反应体系在37℃温浴反应2 h，随后95℃热反应5 min后于-20℃保存。PCR反应采用Bio Dev银牌快速Taq酶（SF-Taq）说明书进行。PCR反应的程序如下：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，33个循环后72 ℃延伸2 min。反应完毕后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

　　1.2.4 农杆菌渗入试验参考文献（魏军亚，2006）并做适当改进：挑取含有pHG12-CPIR载体的农杆菌GV3101单菌落于ΨB液体培养基（含100 mg/L Rif，100 mg/L Spec）中，28 ℃摇床培养至对数生长期生物论文，离心收集菌体。将菌体重悬于含10mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-（N-吗琳）-乙基磺酸（MES，pH5.6）和150 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的缓冲液中。调整菌液浓度使其OD600在1.0左右，室温静止放置2-3 h。用1 mL注射器针头将5-6叶期番木瓜的两片子叶下表皮轻轻刺2～3个孔，并在破处用无针头的注射器针管靠压力将菌液注入番木瓜子叶中，同时以GV3101空载体和不经浸润的番木瓜作为对照。每种处理接种6-7株苗，重复3次论文参考文献格式。将不同处理番木瓜幼苗置于28℃和16 h光照/8h黑暗条件下培养。4 d后进行攻毒试验。

　　1.2.5 拟南芥遗传转化参考文献（Clough and Bent，1998）并做适当改进。选取长势良好且已抽薹的拟南芥植株，除去已开的花和荚，转化前一夜浇足水。挑取含有pHG12-CPIR载体的农杆菌GV3101单菌落于含有相应抗生素的ΨB培养基中（含100 μg/mL Rif和100 μg/mL Spec），28 ℃摇床培养过夜。取1 mL菌液加入到50 mL ΨB培养基中，28 ℃摇床至OD600在1.2-1.6之间。菌液在6000 rpm下离心5 min。倒去上清后用MS渗透培养基重悬菌体至OD600约为0.8。侵染之前加入0.5‰的silwet-77并充分混匀。将植株顶端部分全部浸入菌液中，侵染10-15 s。将侵染后的植株避光过夜，第二天转入正常生长环境下。每隔3 d左右重复侵染一次，共重复3次。3-5周后收取种子做筛选。

　　选取5-6叶期的“夏威夷”番木瓜实生苗作为试验对象，对子叶进行含有目的载体的农杆菌瞬时表达实验，同时设置不接种农杆菌、接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101三个处理间对照生物论文，每个处理进行6－7个生物学重复。农杆菌接种处理完后的番木瓜植株进行保湿处理，在接种农杆菌4 d后对子叶进行攻毒试验，接种番木瓜环斑病毒，在接种病毒7 d后对子叶上部的顶生新叶进行症状观察并作分析。在烟草上，对5-6叶期时的pHG12-CPIR转基因烟草和野生型烟草进行攻毒试验。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理。保证接种病毒的操作一致并保证6-7个生物学重复。在拟南芥上，选取播种30 d的pHG12－2 T2代纯合阳性苗和野生型拟南芥的轮状叶进行攻毒试验，接种方法同烟草。同时设置不接种任何液体（CK）和接种PBS缓冲液两种对照处理论文参考文献格式。7 d后观察表型并作分析。选取代表性的植株进行照相。

　　2 结果

　　2.1 pHG12-CPIR转基因烟草的抗病毒分析

　　接种3 d后观察表型并提取RNA做分析（图2）。表型结果显示处理对照组之间，接种叶并无明显表型差异（见图3a和3b，表2,）。但RT-PCR结果显示，野生型烟草和转pHG12-CPIR基因烟草在接种PRSV病毒后差异明显，野生型烟草中有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而转pHG12-CPIR基因烟草中几乎没有病毒CP mRNA的积累，可以推测转pHG12-CPIR基因烟草中已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图3）。

　　番木瓜环斑病毒

　　图2.烟草叶片总RNA变性凝胶电泳

　　Fig.2.Denaturing gel electrophoresis oftotal RNA from tobacco leaves

　　1、3、5.分别为野生型烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片提取的总RNA；2、4、6.分别为转pHG12-CPIR转基因烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片提取的总RNA。

　　1、3、5.The total RNA of WT tobacco leaves notinoculated，inoculated with PBS and inoculated with PRSV；2、4、6.The total RNA of pHG12-CPIR transformed tobacco leavesnot inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV.

　　图3.病原接种后的表现及RT-PCR检测烟草接种叶片中PRSV CP基因的表达

　　Fig.3.Symptom afterinoculation of PRSV and RT-PCR detection of CP gene expression of PRSVin inoculated tobacco leaves

　　Up: a, transgenic tobaccoplant inoculationwith PRSV. b, wild plant inoculation with PRSV. Down: 1、3、5.分别为野生型烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片；2、4、6.分别为pHG12-CPIR转基因烟草未接种、接种PBS和接种PRSV的叶片。ACTIN为内参基因。

　　1、3、5.WT tobacco leaves not inoculated，inoculatedwith PBS and inoculated with PRSV；2、4、6.pHG12-CPIR transformedtobacco leaves not inoculated，inoculated with PBS andinoculated with PRSV.The ACTIN gene was used asthe internal control.

　　2.2农杆菌介导的番木瓜瞬时表达体系的抗病毒分析

　　结果发现：未接种PRSV的所有处理无明显表型变化，说明阴性对照良好。而不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101在接种PRSV后表型差异明显生物论文，前二者顶生新叶产生明显的枯斑且叶片有皱缩、褪绿的现象，而后者和阴性对照相比无明显表型变化，数据统计结果见表2。约有90%的野生型植株在接种PRSV病原之后，表现出黄化、枯萎和扭曲的症状，而转化植株表现正常（图4a和4b）。RT-PCR结果显示，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101和接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101在接种PRSV后差异明显，不接种农杆菌或接种农杆菌GV3101的番木瓜体内有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101的番木瓜体内几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101的番木瓜体内已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图4）。

　　照

　　图4.病原接种后的表现及RT-PCR检测番木瓜顶生新叶中PRSVCP基因的表达

　　Fig.4. Symptomafter inoculation of PRSV inoculation of PRSV and RT-PCR detection of CPgene expression of PRSV in papaya apicillary leaves

　　Up:上：a, 转基因番木瓜接种PRSV病原。 b, 野生型植株接种PRSV病原。　下：1、4、7.分别为子叶不接种农杆菌后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片；2、5、8.分别为子叶接种农杆菌GV3101后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片；3、6、9.分别为子叶接种农杆菌pHG12-CPIR－GV3101后未接种、接种PBS和接种PRSV的顶生叶片。ACTIN为内参基因。

　　a, transgenicpapaya plant PRSV. b, wild plant inoculation of PRSV. Down:1、4、7.The RT-PCRdetection of papaya apicillary leaves not inoculated，inoculated withPBS and inoculated with PRSV without inoculated with Agrobacterium；2、5、8.papayaapicillary leaves not inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV after inoculated with Agrobacterium GV3101；3、6、9. papayaapicillary leaves not inoculated，inoculated with PBS and inoculated withPRSV after inoculated with Agrobacterium pHG12-CPIR－GV3101.The ACTINgene was used as the internal control.

　　2.3 pHG12-CPIR转基因拟南芥的抗病毒分析

　　对上部非接种轮状叶进行表型观察发现：未接种PRSV的非接种轮状叶无明显表型差异，说明阴性对照良好。而接种了PRSV的野生型拟南芥的非接种轮状叶相比对照有叶片变黄的特征，而接种了PRSV的转基因拟南芥的非接种轮状叶相比对照无明显表型变化，数据统计结果见表2。RT-PCR结果显示，野生型拟南芥和转pHG12-CPIR基因拟南芥在接种PRSV病毒后差异明显，野生型拟南芥中有高浓度的病毒CP mRNA的积累；而转pHG12-CPIR基因拟南芥中几乎没有病毒CP mRNA的积累，说明转pHG12-CPIR基因拟南芥中已启动RNAi机制抑制了CP 基因的表达（图5）。

　　植株的接种试验反应出不任是稳定转化的转基因烟草和拟南芥生物论文，还是农杆菌介导的pHG12-CPIR瞬时表达的番木瓜转化苗，在接种PRSV病原的情况下，从分子水平分析，转化植株都表现出了明显的沉默效果。

　　图5.病原接种后的表现及RT-PCR检测拟南芥非接种轮状叶中PRSV病毒CP基因的表达

　　Fig5.Symptom after inoculation of PRSV and RT-PCR detection of CP gene expression of PRSVin uninoculated arabidopsis rosette leaveslf

　　上：a, 转基因拟南芥接种PRSV病原。 b, 野生型植株接种PRSV病原。 下：1、3、5.分别为野生型拟南芥未接种、接种PBS和接种PRSV的非接种轮状叶；2、4、6.分别为转pHG12-CPIR基因拟南芥未接种、接种PBS和接种PRSV的非接种轮状叶。ACTIN为内参基因论文参考文献格式。

　　Up: a, transgenic arabidopsisinoculation withPRSV. b, wild plant inoculation with PRSV. Down:1、3、5.WT arabidopsisuninoculated rosette leaves not inoculated，inoculatedwith PBS and inoculated with PRSV；2、4、6.pHG12-CPIR transformedarabidopsis uninoculated rosette leaves not inoculated，inoculatedwith PBS and inoculated with PRSV.The ACTIN genewas used as the internal control.

　　2.4 转基因和野生型植株接种PRSV的症状变化

　　从烟草接种试验可以看出，pHG12-CPIR转基因植株接种PRSV后的表现症状与野生型植株相比表型无明显的差异，黄化症状苗各占15.1%和15.8%。接种PRSV后，番木瓜瞬时转化植株的顶生新叶表现皱缩，表现枯斑症状的植株比例为10.3%，转化农杆菌GV3101的对照有79.0%表现病症，而野生型植株有90.0%表现病症。拟南芥接种试验显示：接种PRSV后，转基因植株表现症状和野生型表现症状的植株分别占65.0%和24.5%，统计分析显示其差异显著 （p<0.05）。从形态上看，转基因番木瓜和转基因拟南芥植株在病原浸染后，出现不正常叶片的比例显著下降。

　　表2　转基因植物接种PRSV病原后的形态变化分析

　　Table2 Analysis of modalitycharacteristic in

　　transgenic plantafter inoculated by PRSV pathogen

　　植物

　　Plant

　　症状

　　symptoms

　　接种PRSV后表现症状植株的百分数Percentage of represent symptoms after inoculated with PRSV in plants（%）

　　烟草 Nicotiana tabacum

　　接种叶表现黄化

　　WT

　　1/6 1/7 1/7 15.1a

　　pHG12-CPIR

　　1/6 1/6 1/7 15.8a

　　番木瓜 Caricapapaya L.

　　顶生新叶表现皱缩，有枯斑

　　WT

　　6/6 6/7 6/7 90.0a

　　GV3101

　　5/6 5/7 6/7 79.0a

　　pHG12-CPIR

　　1/6 0/7 1/7 10.3b

　　拟南芥 Arabidopsis thaliana

　　上部非接种叶表现黄化斑驳

　　WT

　　4/6 4/7 5/7 65.0a

　　pHG12-CPIR

　　1/6 2/7 2/7 24.5b

　　3 讨论

　　农杆菌介导的基因瞬时表达体系是一种简单、有效且快速的分析基因表达的研究方法。这种方法的优势是不需要产生转基因的植株就能够生产许多需要的异源蛋白质（Fischer生物论文，1999；2004；Hom，2004）。这种瞬时表达体系常常被用来鉴定一些未知的抑制RNA沉默的抑制子或是一些未知基因的功能分析等（Qu，2003；Thomas，2003）。基因瞬时表达体系相比于稳定表达具有很多方面优点，其中最大的优点就是简便且易于操作。

　　牛颜冰等（2004）发现，如果瞬时表达黄瓜花叶病毒复制酶基因和番茄花叶病毒移动蛋白基因的融合基因的dsRNA能够有效阻止相关病毒的侵染。赵明敏等（2006）发现瞬时表达TMV外壳蛋白基因的dsRNA能够影响TMV的侵染。上述研究结果都表明，在植物体内表达dsRNA都能够引起相关基因的沉默。农杆菌介导的基因瞬时表达体系是一种简单、有效且快速的分析基因表达的研究方法。

　　在本研究中，利用瞬时表达dsRNA的反向重复载体接种番木瓜来降解PRSV的RNA。通过含有PRSV的汁液摩擦接种经过农杆菌浸润的番木瓜子叶表明，经过农杆菌浸润的植株对PRSV的侵染产生了抗性，我们认为这是由于在番木瓜体内导入了由反向重复载体转录形成的dsRNA启动了RNA沉默机制的结果，即瞬时表达CP基因反向重复载体能够形成的dsRNA，从而有效抑制了PRSV对番木瓜植株的侵染。本试验的结果与前人的研究表现出相似的效果（赵明敏等，2006，邱初等，2010）。另外，利用农杆菌瞬时表达体系能将重组的载体快速导入到植株的细胞中去，这样可以快速检测所构建的重组载体是否具有对病毒的侵染产生干扰的能力生物论文，从而可以快速预测所构建的重组载体是否具有抗病毒的沉默效果。为转基因植株的稳定表达提供一定的理论依据。在经农杆菌浸润后的番木瓜子叶上接种病毒，未接种反向重复载体的番木瓜体内，PRSV病毒会由子叶传递到真叶上，说明PRSV能够在番木瓜上进行转移；而接种反向重复载体的番木瓜体内，PRSV病毒不会由子叶传递到真叶上。说明农杆菌瞬时表达体系在番木瓜上得到了运用并且浸润植株体内已启动了RNAi机制抑制了CP 基因的表达。

　　在进行基因功能分析时，常常会用到模式植物作为转基因受体材料，因为模式植物的转化系统相对成熟，容易得到转基因植株，但对其进行病毒接种试验时，往往会受到病原寄主范围的影响论文参考文献格式。在本试验中，番木瓜PRSV在接种到烟草、拟南芥和番木瓜上时，就表现出寄主和非寄主植物的差别。番木番环斑病毒属于马铃薯Y病毒科Potyviridea，马铃薯Y病毒属Potyvirus，该病毒的寄主范围窄，PRSV-P可自然侵染番木瓜和葫芦，用实验方法可传给藜科和葫芦科的15种双子叶植物，PRSV-W能够侵染葫芦科11个属和藜科两个属的38种植物（Yeh　et al生物论文，1985）。由于烟草本身不是PRSV的寄主植物，在PRSV浸染下，烟草表现的症状明显没有在拟南芥和番木瓜上敏感。可能烟草植株自身产生免疫机制或自身具有较强的忍耐力，因而在表型上变化不大。采用番木瓜作转化受体，受病毒浸染时，形态特征更明显。但在mRNA水平上分析，番木瓜，烟草和拟南芥均表现出phRNA介导的沉默效应。因此，观察RNAi的效果，要从形态特征和分子不同的角度进行综合分析。

　　依赖真空渗透的瞬时表达系统是1997年由Kapila等人发展完善的，该表达系统外源蛋白3～5天即能获得高水平的表达，周期短，无环境安全性问题，操作容易，设备简单，目前利用农杆菌真空渗透法已在植物中表达了许多外源蛋白（Olivier et al., 2003, Valentine et al., 2005, Wang et al., 2002） 。李玉玺等（2007）研究指出，用农杆菌真空渗透法在烟草中瞬时表达人酸性成纤维细胞生长因子在真空渗透后4天，外源基因获得最高水平的表达。因此，基因瞬时表达的高峰是有规律可寻的。

　　因此，本研究为快速验证phRNA的沉默效果提供了可借鉴的方法。同时也为建立有效的番木瓜抗病毒基因工程提供了的依据。

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