论文导读：上世纪40年代以来建立的电子显微镜技术，经过不断的改进和提高，己经成为了病毒检测和鉴定的重要方法。研究表明Dot-EuSA比DAs-ELISA灵敏度高，而且经济快捷、直观、成本低，适合种薯生产中大量样品的马铃薯病毒的定性检测。

　　关键词：马铃薯，有害生物，风险分析，病毒检测

　　1.生物学试验方法

　　生物学实验方法也叫指示植物法，其原理是：检测病毒在其鉴别寄主上产生稳定并具有特征性的症状或在其指示植物上快速出现感染症状，从而可以用来检测出某种病毒或检测出某种病毒的存在。在植物病毒的检测上，指示植物法有其他方法所不能替代的地位。

　　生物学实验方法的优点明显，其操作简单易行，成本低廉，通过摩擦或媒介昆虫等方法进行接种，所需毒源材料很少。但这种方法周期较长，前期准备工作量较大。指示植物在不同的环境条件下，表现出的受感染的症状有差异；几种病毒复合侵染时可能引起另-种症状，另外个别症状反应难以重复，鉴别不同的病毒时所需的指示植物也有不同。

　　2.电子显微镜技术

　　电子显微镜技术是通过观察病毒颗粒形态、大小、结果、内含体组成形状和亚结构等方面的特征来确定病毒的存在和种类。上世纪40年代以来建立的电子显微镜技术，经过不断的改进和提高，己经成为了病毒检测和鉴定的重要方法。目前较为重要的有负染色技术、超薄切片技术、免疫电镜技术、放射自显影技术等。

　　通常情况下植物病毒侵染寄主细胞后，常常引起-系列的细胞病理变化，如引起线粒体聚集、膜结构退化、出现大量液泡细胞壁增厚、胞间连丝结构的改变等现象。通过电镜技术就可以直观、快速、简单的既观察到病毒形态结构，又可以发现病毒侵染寄主后引起的细胞超微结构变化。

　　电镜操作需要-定技能，工作量集中但不易太大。电镜技术的检测灵敏度与ELISA反应相似，但不如核酸杂交技术。同时，依据病毒粒体的大小，形态、弯曲程度等特征的判断只能到科或属，较难定性为某种病毒。电镜的观察只能作为一个初步判断。此外，并不是每一种病毒侵染植物都会形成内含体等特殊结构。这些问题的存在都或多或少的制约了电镜技术的广泛应用。论文参考网。

　　3.免疫学方法

　　在现今的植物病毒检测中，使用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸附测定。该方法是上世纪70年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定技术，是一种相对吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原和抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助结合在抗体或抗原上酶与底物的反应所产生的颜色来进行检测。它具有灵敏度高、特异性强、操作简单、适合于测定大量样品、对人体基本无害等诸多的优点。而且克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒体形态和抗血清用量等因素的限制。但是ELISA方法检测病毒也有它的局限性。有时血清学上相关的病毒却在核酸序列上并不完全同源，甚至没有同源性，从而会使ELISA鉴定反应时出现假阳性的现象。ELISA首先是用于人和动物的传染病检查，目前ELISA主要有双抗体夹心法（DAS-ELISA），硝酸纤维素膜法（NCM-ELISA）和快速ELISA三种方法。

　　3.1双抗体夹心法

　　这种方法是以聚苯乙烯塑料管或凝血滴定板为支持物，采用直接ELISA，基本步骤是先加入第-抗体，再-次加入病毒提取液、第二抗体、底物，所以叫做双抗体夹心。

　　3.2硝酸纤维素膜法

　　硝酸纤维素膜法（NCM-ELISA）又称Dot-ELISA，该方法是以NCM为固相载体，通常采用间接ELISA，基本步骤是先将待测样品点在NCM膜上，然后依次加入抗病毒抗体、酶标第二抗体、底物。此法与常规法相比有很多优点，NCM对蛋白质有较高的亲和力，提供蛋白质较大的结合表明，使检测的灵敏度提高，而且反应产生鲜艳的色斑，形成强烈对比。NCM法测定所需的最低病毒量低于常规的ELISA的1000倍。研究表明Dot-EuSA比DAs-ELISA灵敏度高，而且经济快捷、直观、成本低，适合种薯生产中大量样品的马铃薯病毒的定性检测。

　　3.3快速酶联免疫吸附法

　　常规ELISA中各步反应是在静止状态下进行的，快速ELISA中各步反应是在37℃下恒温振摇状态下进行的，抗体、抗原、酶标孵育时间相对缩短，此方法可比常规方法快3.5h。

　　4.分子生物学检测方法

　　分子生物学检测是通过病毒的核酸来检测病毒，它比血清学方法的灵敏度要高，特异性强、检测迅速、操作简洁。目前应用较广的分子生物学技术包括：聚合酶链式反应技术、核酸斑点杂交技术、双链技术、基因芯片技术等。论文参考网。

　　4.1聚合酶链式反应（PCR）

　　聚合酶链式反应（PCR）是Mullis等人发明的-种体外快速扩增特定基因或序列的方法，经过变性-退火-延伸这一循环的反复进行，DNA扩增的数量呈指数增长。对于多数RNA病毒来说，则需要先将RNA基因在逆转录酶作用下合成互补的DNA然后再进行PCR扩增，这称为RT-PeR。论文参考网。

　　RT-PCR技术与免疫学方法相比不需要制备抗体，检测所需的毒源量也仅仅是其的1/1000倍，具有更加灵敏、快速、特异性更强等优势。近年来成为病毒检测和分子生物学科领域最为广泛应用的技术。非特异性扩增是PCR反应原理上的缺陷，实验中可能受到引物、模板等被污染的影响而出现假阳性。因此PCR方法并不是万能或-定准确的检测方式。

　　随着科学技术的发展，基础的RT-PCR技术衍生出了更为多样化更符合检测需要的技术，包括以下凡种：

　　（l）多重RT-PCR

　　此PCR反应体系中使用多对病毒特异性引物，同时扩增多种病毒各自不同的特定基因片段，且扩增片段间大小各不相同，再通过凝胶电泳检测电泳带的多少和大小即可辨别病毒的种类，实现对多种病毒的同时检测。PRusso等、Singh等利用这种方法同时检测了马铃薯卷叶病毒和马铃薯Y病毒。

　　（2）荧光竞争-RT-PCR

　　CF-RT-PCR技术中使用的各种病毒特异性引物分别采用不同的荧光染料标记，不同病毒的PCR产物释放的荧光颜色不同，根据荧光颜色来判断样品中病毒的种类和大小。

　　（3）免疫捕获

　　IC-RT-PCR检测技术是免疫学技术和RT-PCR技术相结合建立起来的检测技术。该技术不需要进行病毒RNA的抽提，操作更容易，并且在不破坏病毒粒体的情况下，既可实现病毒的检测。这种方法为不具备病毒特异性抗体或采用免疫学技术很难检测的病毒提供了一个可行的方法。

　　4.2 PCR反应的影响因素

　　PCR反应体系五要素分别是引物、酶、dNTP、模板和Mg2+;反应条件包括：变性、退火、延伸的温度和时间，反应循环次数。理论上讲，有助于PCR反应的措施都有助于检测灵敏度的提高，如：增加Mg2+的浓度，增加TaqDNA酶的量，增加反应循环次数等。但这些因素的增加并不一定能产生理想的效果。Mg2+的浓度和TaqDNA酶的量过高可引起非特异性扩增，浓度过低则产物生成量又不足，不利于电泳观察；PCR反应的循环次数-般选在30~40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。另外，退火温度的选择是一个很重要的参数，合理的退火温度在能产生大量的扩增产物的同时可大大减少引物和模板间的非特异性结合。

　　另外，PCR反应中因为极其微量的污染就可能造成假阳性的产生，所以应避免标本间的交叉污染、PCR试剂等的污染问题。

　　4.3 核酸斑点杂交技术

　　核酸斑点杂交技术是根据互补的核酸单链可以相互结合的原理，将-段核酸单链以某种方式加以标记，制成探针，与互补的待测病毒核酸杂交，带有病毒原探针的杂交核酸能指示病原的存在。NASH包括以下步骤：样品制备和膜的制备；样品固定和预杂交；洗去剩余探针；放射自显影。研究表明NASH检测技术比ELISA法更灵敏可靠，适合大量样品检测，对病毒和类病毒的侵染诊断更佳，但其灵敏度和特异性不如RT-PeR。

　　4.4双链RNA技术

　　研究发现含有RNA的植物病毒在复制时会产生RNA的复制中间型，即双链RNA。双链RNA在寄主体内存在稳定，可以利用-些物理、化学的方法分离出来，获得纯化的dsRNA。每一种RN.A病毒、类病毒在寄主内有特异的dsRNA，其迁移率、分子量、片段数均不同，而在健康植物组织中无大分子的dsRNA，故dsRNA经提纯、电泳、染色后，在凝胶上所显示的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类。此方法已用于-些病毒组，如马铃薯Y病毒组、烟草坏死病毒组、黄瓜花叶病毒组的分类研究。

　　4.5基因芯片技术

　　基因芯片是采用高速打印和光刻合成技术在硅玻璃或尼龙膜上制造阵列，样品DNA/RNA通过PCR扩增和体外转录等技术渗入荧光标记分子，与微阵列杂交后通过荧光扫描仪扫描，及计算机分析即可获得样品中大量基因顺序及表达的信息。基因芯片可以分为两大类，-时原位合成，其适合于寡核昔酸；二是直接点样，多用于大片段DNA。基因芯片技术目前还是很多不足，例如需要提高基因芯片特异性、简化样品制备和标记操作、增加信号检测灵敏度等。

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